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接下來說說免疫熒光實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)步驟到底是什么吧
發(fā)布時(shí)間： 2022-07-26 點(diǎn)擊次數(shù)： 1360次免疫熒光實(shí)驗(yàn)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光（黃綠色或桔紅色），可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。免疫熒光實(shí)驗(yàn)技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。免疫熒光實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)步驟：1、細(xì)胞準(zhǔn)備。對單層生長細(xì)胞，在傳代培養(yǎng)時(shí)，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次;對懸浮生長細(xì)胞，取對數(shù)生長細(xì)胞，用PBS離心洗滌(1000rpm,5min)2次，用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。2、固定。根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭?xì)胞。固定完畢后的細(xì)胞可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個(gè)月。PBS洗滌3×5min.3、通透。使用交聯(lián)劑(如多聚甲醛)固定后的細(xì)胞，一般需要在加入抗體孵育前，對細(xì)胞進(jìn)行通透處理，以保證抗體能夠到達(dá)抗原部位。選擇通透劑應(yīng)充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。通透的時(shí)間一般在5-15min.通透后用PBS洗滌3×5min.4、封閉。使用封閉液對細(xì)胞進(jìn)行封閉，時(shí)間一般為30min.5、一抗結(jié)合。室溫孵育1h或者4℃過夜。PBST漂洗3次，每次沖洗5min.6、二抗結(jié)合。間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次沖洗5min后，再用蒸餾水漂洗一次。7、封片及檢測。滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。
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