穩(wěn)轉株篩選實驗服務
一、實驗目的
穩(wěn)轉株篩選實驗服務的主要目的是獲得能夠長期穩(wěn)定表達特定基因或干擾特定基因表達的細胞系，以便于長期觀察和檢驗基因對細胞功能以及蛋白相互作用的影響。
二、實驗原理
通過將外源DNA/shRNA克隆到帶有某種抗性基因的載體上，重組載體轉染至宿主細胞并整合到其染色體中，并隨細胞分裂穩(wěn)定傳遞。最后用載體中所含的抗性基因進行篩選，以獲得穩(wěn)定表達目標基因的細胞株。
三、實驗步驟
?目標基因選擇?：
確定需要在細胞中穩(wěn)定表達的目標基因。
構建質粒，將目標基因與抗性基因結合。
?載體選擇?：
使用能夠整合到宿主基因組中的載體，如慢病毒載體或逆轉錄病毒載體。
質粒載體也可用于實驗，但需要較高效的轉染方法和篩選策略。
?轉染方法?：
根據細胞類型選擇適合的轉染方法，如脂質體轉染、電穿孔等。
對于某些細胞，可能需要使用慢病毒或逆轉錄病毒感染。
?優(yōu)化條件?：
優(yōu)化轉染條件，包括DNA濃度、細胞密度和轉染試劑用量，以提高轉染效率。
確定適合的MOI（感染復數），以確保高效的基因整合和表達。
?篩選抗性基因?：
在轉染或感染后的24-48小時，添加選擇性抗生素或藥物（如G418、meifensuanzhi等），濃度需根據預先的滴定實驗確定。
篩選通常持續(xù)1-2周，直到未轉染的細胞被殺死，而轉染成功的細胞存活下來。
?稀釋單克隆篩選?：
如果需要獲取單克隆穩(wěn)轉株，將篩選后的細胞進行極限稀釋，接種到96孔板中，每孔接種單個細胞。
待單細胞克隆長成小群體后，通過顯微鏡觀察并挑選生長良好的克隆進行進一步擴增。
?驗證表達?：
提取篩選后細胞的RNA和蛋白，通過qRT-PCR和Western blot檢測目標基因的mRNA和蛋白表達水平。
如果目標基因帶有熒光標簽（如GFP），可以通過熒光顯微鏡直接觀察表達和定位。
使用PCR或Southern blot檢測目標基因是否整合到宿主基因組中。
?細胞功能分析?：
根據研究目的，進行相關的功能實驗，如細胞增殖、凋亡、遷移等，驗證目標基因在穩(wěn)轉株中的生物學功能。
?長期穩(wěn)定性檢測?：
持續(xù)培養(yǎng)穩(wěn)轉株，定期檢測目標基因的表達水平，評估其在長期培養(yǎng)中的穩(wěn)定性。
